Methoden

Als Zytologie bezeichnet man die Untersuchung von einzelnen Zellen oder kleinen Zellverbänden. Diese stammen gewöhnlich aus dem Blut oder dem Knochenmark, aber auch aus dem Liquor und aus Körperergüssen (Pleuraerguß, Aszites).

Aus Blut oder Knochenmark werden Ausstrichpräparate angefertigt, während die Zellen aus dem Liquor und den Körperergüssen durch Zentrifugation angereichert und auf Objektträger aufgebracht werden (Zytospins).

Bedeutung

Die große Bedeutung der zytologischen Diagnostik ergibt sich vor allem aus der Tatsache, dass bei geringem Aufwand mit hoher Wahrscheinlichkeit eine klinische Diagnose gestellt werden kann.

Vorteile der Zytologie

  • Es ist  kein spezielles Equipment notwendig.
  • Die Probengewinnung erfolgt minimal invasiv.
  • Die Ergebnisse stehen nach kurzer Zeit zur Verfügung.
  • Operationsbegleitend durchgeführt kann eine  zytologische Untersuchung bereits intra operationem Grundlage für weitere Entscheidungen sein.

Folgende Färbemethoden wenden wir an:

Methoden

Zytologie

Pappenheim (May-Grünwald-Giemsa)

HE (Hämatoxylin-Eosin)

Eisennachweis (Berliner Blau)

PAS (Perjodsäure-Schiff)

ASDCL (AS-D-Cloracetat-Esterase)

POX (Peroxidase)

SE (saure Esterase)

Die Immunhistochemie dient dazu, spezifische Strukturen auf den Zellen sichtbar zu machen, die es ermöglichen, auch äußerlich identische Zellen einem bestimmten Zelltyp zuzuordnen. Dazu werden Antikörper verwendet, die spezifisch an die gesuchten Strukturen binden und dann mit Hilfe sensitiver Detektionsmethoden sichtbar gemacht werden können.

In der Hämatopathologie dient sie vor allen Dingen dazu, die sehr ähnlich oder sogar identisch aussehenden, aber funktionell sehr unterschiedlichen Zellen sowohl des Immunsystems als auch der Blutbildung sicher zu identifizieren.

In der allgemeinen Pathologie lassen sich damit zum Beispiel auch die Zellen einer Metastase einem bestimmten Organ zuordnen. Damit kann der Primärtumor identifiziert werden.Die Immunhistochemie wird bei uns automatisiert durchgeführt.

Zur Visualisierung dient ein Polymer-basiertes Detektionssystem. Derzeit werden bei uns pro Tag ca. 600-700 verschiedene Färbungen mit Hilfe von über 150 verschiedenen Primärantikörpern bearbeitet.

Methoden

Immunhistochemie*

zahlreiche Antikörper, z.B. zur Proliferationsbestimmung, Zelldifferenzierung, Hormon- u.a. -Rezeptoren, gegen Viren/Bakterien

PD-L1

HER2

Erregernachweis

HHV8

EBV

*alle Färbungen mit standardisierten, qualitätsgesicherten Färbeverfahren

Die konventionelle Histologie untersucht Gewebeproben, die operativ oder mittels einer Biopsie entnommen worden sind, um krankhafte Veränderungen festzustellen.

Dazu werden die Gewebeproben in einem aufwändigen Verfahren entwässert und in Paraffin eingebettet. Mittels eines Mikrotoms werden die entstandenen Blöcke in mikrometerdünne Schnitte zerlegt, die mit besonderen Färbetechniken gefärbt und dann unter dem Mikroskop analysiert werden können. Die Schnittherstellung am Mikrotom verlangt großes Geschick.

Während in der allgemeinen Pathologie häufig eine exakte Diagnosestellung mit Hilfe der konventionellen Histologie möglich ist, dient diese in der Hämatopathologie als Grundlage für weiterführende Untersuchungen, wie Immunhistochemie und gegebenenfalls molekulare Untersuchungen.

Schnellschnitthistologie

Bei einigen operativen Eingriffen ist es erforderlich, bereits während der Operation diagnostische Aussagen zum entnommenen Gewebe zu erhalten. Dabei geht es vor allen Dingen um die Abgrenzung von bösartigen Tumoren vom gesunden Gewebe.

Hier wird die Schnellschnitt-Histologie verwendet. Aus Zeitgründen wird auf das aufwändige Einbettverfahren verzichtet. Das Gewebe wird tiefgefroren, am Kryostat-Mikrotom bei –20°C geschnitten und im Schnellverfahren gefärbt.

Das Schnellschnitt-Verfahren ist weniger exakt als die Paraffin-basierte Histologie, erlaubt aber eine vorläufige Diagnose innerhalb von 10-20 Minuten. Die Schnellschnittdiagnose liefert dem Chirurgen wichtige Informationen für die weitere operative Strategie.

Färbemethoden in der Histologie

Folgende Färbemethoden wenden wir an:

Methoden

Histologie

HE (Hämatoxylin-Eosin)

Giemsa

Eisennachweis (Berliner Blau)

ASDCL (Naphtol-AS-D-Chloracetatesterase-Färbung)

PAS (Perjodsäure-Schiff)

Versilberung nach Gomori

Amyloidnachweis (Kongorot)

Bakterioskopie

Auramin-Rhodamin

Ziehl-Neelsen

Gram

Fungiqual (Fluoreszenz)

GROCOTT-Färbung

Weitere Färbemethoden

Alcianblau

Diastase-PAS

Sudan III Fettfärbung

Kalknachweis nach Kossa

Masson Trichom Goldner

Papanicolaou

Rhodamin

van Gieson

Warthin Starry Versilberung

kombinierte Elastica van Gieson

weitere Sonderfärbungen

Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Methode zum Nachweis von spezifischen DNA- und RNA-Sequenzen direkt auf dem histologischen Schnittpräparat (in situ).

Die nachzuweisenden Sequenzen können virale RNA oder DNA sein oder auch Translokationen, Deletionen und Amplifikationen von humanen Genen beinhalten. Spezifische Sonden (= komplementäre DNA-Abschnitte) werden an die gesuchten Sequenzen gebunden und mit Hilfe diverser Färbemethoden im Zellkern sichtbar gemacht.

Chromogene Färbungen (CISH) werden bei uns für den Nachweis viraler RNA sowie von Genamplifikation verwendet, während Fluoreszenzfarbstoffe (FISH) derzeit hauptsächlich zur Detektion von Translokationen und Deletionen dienen.

Die Stärke der Methode liegt darin, dass sie es möglich macht, eine bestimmte genetische Aberration direkt der betroffenen Zelle zuzuordnen. Dadurch ist es möglich, z.B. bei Genamplifikation, einen Unterschied zwischen Tumor- und Normalgewebe zu detektieren.

fish

Methoden

CISH

EBER, HER2, EGFR

FISH

NHL

IgH-BCL2 t(14;18)(q32;q21)

BCL2 Translokation

IgH Translokation

IgH-CCND1 t(11;14)(q13;q32)

CCND1 Translokation

PAX5

MALT1

BCL6 Translokation

MYC Translokation

CLL

del17q (TP53)

del11q

del13q

Trisomie 12

del6q23 (c-myb)

IgH-BCL3 t(14;19)(q32;q13)

T-PLL

TCR alpha/delta (inv14)

Akute Leukämien

BCR-ABL

FLT3 (ITD/TKD)

NPM1

IDH1/2

MYC Translokation

CBFB (inv16)

PML-RARa t(15;17)(q22;q12)

RARA-Translokation

Myeloproliferative Erkrankungen

BCR-ABL

FIP1L1-PDGFRA (del in 4q12)

PDGFRB Translokation

Myelodysplastische Erkrankungen

5q- (del5q)

-7/7q- (del7/del7q)

Next Generation Sequencing (NGS)

Die Anzahl der molekularen Marker in malignen Erkrankungen mit diagnostischer und prognostischer Relevanz hat in den letzten Jahren rasant zugenommen. Diese Marker können beispielsweise zur Abschätzung der Wirksamkeit von zielgerichteten Therapien oder bei Differentialdiagnosen von schwer diagnostizierbaren Erkrankungen genutzt werden. Allerdings ist die Analyse einer immer größer werdenden Zahl an Markern arbeitsaufwendig und teuer, da mit klassischen Methoden wie z.B. der Sanger Sequenzierung nur eine begrenzte Anzahl Proben parallel sequenziert werden kann.

Sanger Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierung ist heute eines der wichtigsten Instrumente in der Molekularpathologie. Für eine Vielzahl von Erkrankungen, insbesondere Krebs- und vererbbare Erkrankungen konnten Veränderungen in der Erbinformation (sogenannte Mutationen in der DNA) als wichtige Faktoren bei der Entstehung und Progression identifiziert werden. Solche Veränderungen lassen sich aufspüren, indem man eine Sequenzierung der DNA-Bereiche durchführt, von denen man weiß, dass sie eine wichtige Rolle in bestimmten Erkrankungen spielen.

PCR/qPCR

Mit der Polymerase-Kettenreaktion (englisch Polymerase Chain Reaction, PCR) lässt sich DNA (Träger der genetischen Informationen) fast unbegrenzt vervielfältigen. Aus wenigen DNA-Molekülen lassen sich in kurzer Zeit Milliarden Kopien herstellen.

Damit ist es heute möglich winzigste DNA-Spuren nutzen zu können, z.B. an Tatorten („genetischer Fingerabdruck“), bei der Behandlung von Krankheiten (wenige Tumor- oder Bakterienzellen können für eine Diagnose reichen) oder bei Vaterschaftstests.

CISH / FISH

Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Methode zum Nachweis von spezifischen DNA- und RNA-Sequenzen direkt auf dem histologischen Schnittpräparat (in situ).

Die nachzuweisenden Sequenzen können virale RNA oder DNA sein oder auch Translokationen, Deletionen und Amplifikationen von humanen Genen beinhalten. Spezifische Sonden (= komplementäre DNA-Abschnitte) werden an die gesuchten Sequenzen gebunden und mit Hilfe diverser Färbemethoden im Zellkern sichtbar gemacht.

Molekularpathologische Analysen können nicht nur an in Paraffin eingebettetem Material durchgeführt werden, sondern auch an frei zirkulierender DNA (ctDNA), die von in Apoptose befindlichen Tumorzellen abgesondert wird. Diese ctDNA kann aus Blutproben angereichert und sequenziert werden. Die von uns eingesetzte Hybrid-Capture-NGS-Technologie ist hochsensitiv und kann neben Mutationen auch Translokationen detektieren.

Mammakarzinom – ESR1-Diagnostik

Im September 2023 hat die Europäische Arzneimittelagentur (EMA) das neue Medikament Orserdu (Elacestrant) zugelassen. Anwendungsgebiet ist die Monotherapie zur Behandlung von postmenopausalen Frauen sowie von Männern mit Östrogenrezeptor (ER)-positivem, HER2-negativem, lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem Brustkrebs mit einer aktivierenden ESR1-Mutation, deren Erkrankung nach mindestens einer endokrinen Therapielinie, einschließlich eines CDK 4/6-Inhibitors, fortgeschritten ist. Damit besteht unmittelbar die Notwendigkeit, die ESR1-Mutation als Biomarker für das Ansprechen auf eine medikamentöse Therapie zu untersuchen. Die Zulassung sieht vor, dass die Testung dabei zwingend mittels Liquid Biopsy am Blut erfolgen muss.

Wir bieten eine Liquid-Biopsy-Diagnostik mit Hybrid-Capture-NGS-Technologie an, mit der sämtliche relevanten ESR1-Mutationen hochsensitiv mit einem validierten Assay detektiert werden können.

Lungenkarzinom

Wir führen seit vielen Jahren Next-Generation-Sequencing-basierte Paneltests an Liquid-Biopsy-Proben von Lungenkrebspatienten durch. Die Technologie kommt insbesondere dann zum Einsatz, wenn bereits ein gesichertes Lungenkarzinom vorliegt, aber nicht genug Gewebe für eine molekulare Testung zur Verfügung steht, oder das molekulare Profil des Tumors bei Resistenz gegenüber zielgerichteten Therapien analysiert werden soll. Eine Erstattung ist über Verträge zur besonderen Versorgung sowohl über das Lungennetzwerk Nowel (Nowel.org) oder nNGM über die Lungenkrebsmedizin Oldenburg möglich.

Zur Publikationen

Präanalytische Voraussetzungen

In der Liquid-Biopsy-Analytik, bei der die vom Tumor abgesonderte DNA sequenziert werden soll, ist es wichtig, dass die Blutproben nicht durch DNA von in der Probe enthaltenen Lymphozyten verfälscht werden. Daher ist es nicht möglich, die Analytik an regulären EDTA-Blutröhrchen durchzuführen. Die Blutproben müssen in speziell für die Liquid Biopsy vorgesehenen Blutentnahmeröhrchen versandt werden. Wir verwenden hierfür ausschließlich ctDNA-Röhrchen von der Firma Streck, die leider nur sechs Monate haltbar sind. Gerne schicken wir Ihnen auf Anfrage die entsprechenden Blutröhrchen zu (info@hp-hamburg.de oder telefonisch 040 707085-200).

Die molekulare Testung der Genomischen Instabilität ist seit der Zulassung von Olaparib plus Bevacizumab in der Erstlinien-Erhaltungstherapie bei Patientinnen mit fortgeschrittenem high-grade serösem Ovarialkarzinom eine Notwendigkeit geworden.

In normalen Körperzellen können DNA-Doppelstrangbrüche durch den Mechanismus der Homologen Rekombinations-Reparatur (HRR) fehlerfrei repariert werden. Ein Verlust dieser Fähigkeit durch Mutationen in den relevanten HRR-Genen wird als Homologe Rekombinations-Defizienz (HRD) bezeichnet.
Eine HRD kann sowohl durch somatische als auch durch Keimbahnmutationen in den BRCA1/2 Genen sowie weiterer HRR-Gene verursacht werden und resultiert in einer Genomischen Instabilität der Tumorzellen.

Für die Bestimmung des Genomischen Instabilitäts-Status (GIS) als Biomarker zur Abschätzung der Wirksamkeit von PARP-Inhibitoren bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom steht am HpH ein Next-Generation-Sequencing (NGS) basiertes Assay für eine Testung zur Verfügung.

NOGGO GIS Assay V1

Der NOGGO GIS Assay V1 wurde als akademischer Assay in Zusammenarbeit mit dem NOGGO e.V. (Nord-Ostdeutsche Gesellschaft für Gynäkologische Onkologie) entwickelt und mit 383 Proben aus der PAOLA-1 Studie validiert. Die robuste Chemie das Assays ermöglicht bei geringer Fehlerrate die zuverlässige Bestimmung des HRD-Status aus minimal 40ng DNA einer Tumorprobe.

Die kürzlich auf den ASCO präsentierten und in Cancers publizierten Validierungsdaten (Citation: Willing, E.-M.; Vollbrecht, C.; Vössing, C.; Weist, P.; Schallenberg, S.; Herbst, J.M.; Schatz, S.; Jóri, B.; Bataillon, G.; Harter, P.; et al. Development of the NOGGO GIS v1 Assay, a Comprehensive Hybrid-Capture-Based NGS Assay for Therapeutic Stratification of Homologous Repair Deficiency Driven Tumors and Clinical Validation. Cancers 2023, 15, 3445. https://doi.org/10.3390/ cancers15133445) zeigen im Vergleich zum PAOLA-1 Studienassay nahezu identische Ergebnisse für PFS und OS bei zugleich geringen Ausfallraten:

PFS (A,B) and OS (C,D) data of 383 patients of the PAOLA-1 clinical trial analyzed with either Myriad MyChoice (cutoff ≥ 42) or the NOGGO GIS v1 assay (cutoff ≥ 83).

 

Subgroup analysis of patients successfully analyzed with the NOGGO GIS v1 assay for Figure 5. Subgroup analysis of patients successfully analyzed with the NOGGO GIS v1 assay for which no results with Myriad MyChoice could be obtained.

 

Der NOGGO GIS Assay V1 ist Teil eines modularen Labor- und bioinformatischen Workflows mit dem zusätzlich zum Genomischen Instabilitäts-Status weitere genomische Veränderungen bestimmt werden:

  • Mutationen in den BRCA1- und BRCA2-Genen inklusive großer Deletionen
  • alle Exone der HRR-Gene (RAD51, PALB etc.)
  • LOH von Tumorsuppressorgenen
  • Detektion therapeutisch relevanter Treibermutationen bei HRD-negativen Patienten/innen: HER2 Amp., KRAS, BRAF, PIK3CA, EGFR etc.

» Anforderung: bitte Genomische Instabilität (HRD) und BRCA1/2 anfordern

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