PCR / qPCR

Die Polymerase-Kettenreaktion (englisch Polymerase Chain Reaction, PCR) hat die Molekularbiologie revolutioniert und ist heute wohl das meistgenutzte molekularbiologische Verfahren überhaupt. Mit dieser Methode lässt sich DNA (Träger der genetischen Informationen) fast unbegrenzt vervielfältigen. Aus wenigen DNA-Molekülen lassen sich in kurzer Zeit Milliarden Kopien herstellen. Damit ist es heute möglich winzigste DNA-Spuren nutzen zu können, z.B. an Tatorten („genetischer Fingerabdruck“), bei der Behandlung von Krankheiten (wenige Tumor- oder Bakterienzellen können für eine Diagnose reichen) oder bei Vaterschaftstests.

Die Polymerase-Kettenreaktion selbst wurde 1983 von Kary Mullis in Kalifornien, USA erfunden. Er suchte nach einer neuen Methode, mit der sich DNA schneller und günstiger vervielfältigen ließ, als mit bekannten chemischen Methoden. Die von ihm dann entwickelte Methode stellte sich als so bahnbrechend heraus, dass Mullis dafür 1993 den Nobelpreis für Chemie erhielt. (Von seinem damaligen Arbeitgeber erhielt Mullis nur eine Prämie in Höhe von 10.000 US-Dollar, während die Rechte für die PCR kurz darauf für 300 Millionen US-Dollar an die Firma Roche verkauft wurden.)

 

Das Prinzip der PCR ist relativ einfach und daher auch sehr robust (siehe Abbildung 1). Der Bereich, der vervielfältigt werden soll, lässt sich nahezu frei bestimmen. Dafür werden kurze DNA-Stücke, die „Primer“ verwendet. Diese Primer werden von der DNA-Polymerase als „Starthilfe“ benötigt. Sie lagern sich an die Ausgangs-DNA an und begrenzen zu beiden Seiten den Bereich, der vervielfältigt werden soll.

 

Eine typische PCR besteht aus drei Schritten, die zyklisch wiederholt werden. In jedem dieser Zyklen  wird die DNA (theoretisch) verdoppelt. Im ersten Schritt (Denaturierung) werden die beiden DNA-Stränge der Ausgangs-DNA durch Hitze getrennt („aufgeschmolzen“). Im zweiten Schritt (Annealing, Anlagerung) binden die Primer an die Ausgangs-DNA. Im letzten Schritt (Elongation, Verlängerung) wird die Temperatur bei 72°C (dem Temperaturoptimum der meisten thermostabilen DNA-Polymerasen) gehalten. Die DNA-Polymerase verlängert die Primer und kopiert dabei die Ausgangs-DNA. Der Primer selbst wird dabei selbst zum Anfang des kopierten DNA-Stranges. Die DNA hat sich damit verdoppelt und anschließend beginnt der Zyklus wieder von vorne.

Die vervielfältigte DNA kann dann analysiert werden, zum Beispiel mittels Gel- oder Kapillarelektrophorese (siehe Abbildung 2) oder sie kann für andere Verfahren, z. B. eine DNA-Sequenzierung genutzt werden.

 

Das Prinzip der PCR

Abbildung 1

 

 

Nachweis von Mutationen mit einer einfachen PCR

 

 

Abbildung 2

 

 

Das Prinzip der real time PCR

 

Die real time PCR

Eine häufig genutzte Variante der PCR ist die real-time-PCR (kurz RT-PCR). Mit dieser sehr sensitiven und reproduzierbaren Methode lässt sich das Vorhandensein von spezifischen Mutationen in Echtzeit bestimmen. Es werden unterschiedlich fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden benutzt, die an die untersuchungsrelevanten Abschnitte der DNA binden. Für die nicht-mutierte DNA und jede Mutation, auf die hin untersucht werden soll, wird jeweils eine eigene, spezifische Sonde benötigt. Daher muss die Art der zu untersuchenden Mutationen dabei (im Gegensatz zur Sequenzierung) bereits bekannt sein. Dafür ist diese Methode im Vergleich zur Sequenzierung sehr schnell und kostengünstig durchzuführen und ermöglicht damit eine zeitnahe Untersuchung von klinisch relevanten Mutationen.

Es gibt verschiedene Arten von RT-PCRs, wobei die Analyse immer auf DNA-gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen beruht. Die untersuchungsrelevanten DNA- oder RNA-Abschnitte werden, ähnlich wie in einer PCR, vervielfältigt und dabei Fluoreszenz freigesetzt. Letzteres geschieht allerdings nur, wenn auch eine Sonde an die zu vervielfältigende DNA gebunden hat (siehe Abbildung 3). Anhand der unterschiedlichen Fluoreszenzfarben der Sonden kann ermittelt werden, welche Sonde bindet und damit auch, ob eine Mutation vorliegt oder nicht. Die Fluoreszenz wird detektiert und von der Intensität der Fluoreszenz kann auch auf die Menge an vervielfältigter DNA geschlossen werden. Durch die Vervielfältigung lassen sich selbst geringste Mengen (wenige Moleküle können reichen!) einer DNA oder RNA in der Probe nachweisen und gegebenenfalls quantifizieren (siehe Abbildung 4).

 

 

Abbildung 3

 

 

Quantitative PCR: Beispiele

 

 

Abbildung 4