Next Generation Sequenzierung

Die Anzahl der molekularen Marker in malignen Erkrankungen mit diagnostischer und prognostischer Relevanz hat in den letzten Jahren rasant zugenommen. Diese Marker können beispielsweise zur Abschätzung der Wirksamkeit von zielgerichteten Therapien oder bei Differentialdiagnosen von schwer diagnostizierbaren Erkrankungen genutzt werden. Ermöglicht wurde die Entdeckung dieser neuen Mutationen durch die Verbreitung von Sequenziersystemen der 2. Generation („next generation sequencing“; NGS). Diese Systeme ermöglichen eine relativ günstige und schnelle Sequenzierung kompletter Genome, sodass in den letzten Jahren eine Vielzahl von Tumorentitäten „durchsequenziert“ werden konnten.

 

Allerdings ist die Analyse einer immer größer werdenden Zahl an Markern arbeitsaufwendig und teuer, da mit klassischen Methoden nur eine begrenzte Anzahl Proben parallel sequenziert werden kann. Daher verwenden wir zunehmend NGS-Sequenziersysteme für die Mutationsanalyse.

 

NGS eignet sich besonders für die Analyse von Mutationen, die zu einem Funktionsverlust eines Proteins führen. Im Gegensatz zu aktivierenden Mutationen können diese Veränderungen an vielen Stellen eines Gens auftreten. Daher ist es oft nötig, den Großteil des Gens komplett zu sequenzieren, eine Aufgabe, die mittels NGS schneller und günstiger durchführbar ist. Auch die Mutationsanalyse mehrerer Gene parallel, sogenannter „Gene Panels“, ist ohne größeren Mehraufwand möglich.

 

Beim NGS werden die zu untersuchenden Zielsequenzen zunächst mittels PCR vervielfältigt („Target Enrichment“). Jedes PCR-Produkt wird dann einzeln an ein ca. 28 µM großes Nanobead gebunden und in einer Öl-Emulsions-PCR millionenfach vervielfältigt (klonale Amplifikation). Die Nanobeads, mit den daran hängenden PCR-Produkten, werden anschließend auf einen Chip gegeben, auf dem sich etwa 1,6 Millionen Vertiefungen befinden, in die jeweils ein Nanobead passt. Die so separierten DNA-Moleküle werden jedes einzeln für sich in einem parallelen Prozess sequenziert. Dabei entstehen für jeden untersuchten Genabschnitt eine große Zahl an Sequenzen (mehrere Hundert bis mehrere Tausend). So können selbst geringe Mengen an mutierten DNA-Molekülen detektiert werden, die Sensitivität liegt bei ca. 2%. Damit ist es möglich, beispielsweise Subklone mit spezifischen Mutationen zu identifizieren oder Proben mit geringem Tumoranteil analysieren zu können.

 

Aufgrund dieser Eigenschaften des Next Generation Sequencing ist es uns möglich, molekulare Veränderungen in Genen wie TET2, CBL, RUNX1, ASXL1 oder TP53 mit hoher Sensitivität und Genauigkeit zu detektieren.